Le projet s’est d\u00e9roul\u00e9 sans encombre, \u00e0 l’exception de ce point d’interrogation. Et maintenant, votre chercheur principal vous demande d’identifier l’acteur manquant pour r\u00e9soudre le myst\u00e8re. Vous allez donc sur Google ou PubMed et commencez \u00e0 chercher des moyens d’identifier des prot\u00e9ines inconnues. La r\u00e9ponse \u00e0 votre question est claire : vous avez besoin de la spectrom\u00e9trie de masse. <\/p>\n\n\n\n
Mais vous ne savez pas comment il fonctionne et vous devrez l’expliquer lors de la prochaine r\u00e9union du laboratoire.<\/p>\n\n\n\n
Nous pouvons vous aider.
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Comment pr\u00e9parer votre \u00e9chantillon pour l’identification des prot\u00e9ines par spectrom\u00e9trie de masse ?<\/h2>\n\n
Cela d\u00e9pend vraiment de la mani\u00e8re dont vous avez d\u00e9couvert que vous aviez une prot\u00e9ine \u00e0 identifier. Avez-vous purifi\u00e9 votre prot\u00e9ine d’int\u00e9r\u00eat et trouv\u00e9 une autre prot\u00e9ine \u00e9lu\u00e9e \u00e0 partir de la pr\u00e9paration ? Ou avez-vous fait une immunopr\u00e9cipitation de votre prot\u00e9ine cible et color\u00e9 le gel SDS PAGE pour trouver une bande principale en plus de votre app\u00e2t ? <\/p>\n\n
Dans tous les cas, vous devrez refaire le protocole avec du mat\u00e9riel propre pour limiter la contamination de votre \u00e9chantillon par les k\u00e9ratines.<\/p>\n\n\n\n
Ces prot\u00e9ines g\u00eanantes sont pr\u00e9sentes partout et peuvent r\u00e9ellement entraver l’identification de votre prot\u00e9ine si elles sont trop concentr\u00e9es dans votre \u00e9chantillon.<\/p>\n\n\n\n
Comme nous allons nous concentrer sur l’identification d’une prot\u00e9ine \u00e0 partir d’un gel, nous vous sugg\u00e9rons de jeter un coup d’\u0153il \u00e0 notre protocole d’identification d’une prot\u00e9ine \u00e0 partir d’un gel color\u00e9 au bleu de Coomassie pour avoir un exemple de l’exp\u00e9rimentation elle-m\u00eame. Comme indiqu\u00e9 dans notre article sur la pr\u00e9paration des \u00e9chantillons, vous devez toujours travailler avec des gants, des pointes de pipette filtr\u00e9es et des tubes Eppendorf \u00e0 faible liant. Cela am\u00e9liorera grandement la r\u00e9cup\u00e9ration des peptides et la r\u00e9ussite de votre exp\u00e9rience. Quelle que soit la m\u00e9thode de pr\u00e9paration des \u00e9chantillons que vous utilisez, vous devez garder \u00e0 l’esprit qu’en spectrom\u00e9trie de masse, vous devez toujours travailler dans un environnement propre et avec des outils appropri\u00e9s. <\/p>\n\n\n\n
Comme vous le savez, les prot\u00e9ines sont en fait une cha\u00eene d’acides amin\u00e9s li\u00e9s entre eux de mani\u00e8re covalente. Afin d’identifier votre prot\u00e9ine par LC-MS\/MS, vous devez la d\u00e9composer en parties plus petites, appel\u00e9es peptides. Cela se fait g\u00e9n\u00e9ralement par digestion enzymatique \u00e0 l’aide d’enzymes prot\u00e9olytiques, telles que la trypsine ou la chymotrypsine. Le choix de l’enzyme \u00e0 utiliser est d\u00e9termin\u00e9 par la s\u00e9quence de la prot\u00e9ine en question. <\/p>\n\n\n\n
Dans le cas d’une prot\u00e9ine inconnue, nous choisissons g\u00e9n\u00e9ralement la trypsine en raison de son faible taux de mauvais clivage et de sa forte activit\u00e9 dans des tampons plut\u00f4t d\u00e9naturants. L\u00e0 encore, le protocole de digestion enzymatique variera en fonction de la matrice dans laquelle se trouve votre prot\u00e9ine. Si elle se trouve dans un tampon \u00e0 l’\u00e9tat relativement pur (provenant d’une purification par HPLC, par exemple), il est probable que vous puissiez simplement ajouter l’enzyme et proc\u00e9der \u00e0 la digestion. Si votre prot\u00e9ine se trouve dans un gel, la proc\u00e9dure peut \u00eatre un peu plus complexe. Le r\u00e9sultat final devrait cependant toujours \u00eatre le m\u00eame : un m\u00e9lange de peptides propre que vous pouvez analyser par LC-MS\/MS. <\/p>\n<\/div>\n\n\n\n