On ne peut pas détecter ce que l’on n’injecte pas

par Jessica Nickerson, Research Associate

La précipitation a précédemment été marquée par de faibles taux de récupération et des biais dans la récupération des protéines hydrophiles, de haut poids moléculaire et acides. Comme nous le savons, les données de la spectrométrie de masse ne peuvent refléter que la fraction de l’échantillon qui est injectée, il est donc essentiel que chaque étape du workflow préparatoire conserve le profil natif du protéome. De l’extraction au nettoyage en passant par le fractionnement et les approches d’enrichissement, il existe de nombreuses possibilités de fausser le profil du protéome. Il est facile d’imaginer comment ces types de biais peuvent être extrêmement problématiques dans les cas où l’analyte ciblé présente une abondance relativement faible, ou lorsqu’une quantification précise est nécessaire.

L’un des principaux objectifs de la communauté protéomique est d’identifier des biomarqueurs diagnostiques et pronostiques robustes, afin de faciliter la détection de maladies difficiles à diagnostiquer. Cependant, un échantillon aussi complexe que le sang, par exemple, est composé de 12 protéines qui représentent 95 % de l’échantillon, les 5 % restants comprenant des protéines dont la concentration peut être inférieure de 10 ordres de grandeur à celle des protéines les plus abondantes. Souvent, les protéines les plus abondantes sont appauvries [1], mais il est essentiel que les protéines moins abondantes soient quantitativement conservées dans le reste du workflow afin d’optimiser la précision de la caractérisation par spectrométrie de masse qui s’ensuit.

Le workflow du ProTrap XG permet d’utiliser des tampons d’extraction efficaces, contenant jusqu’à 1% de SDS, avec la promesse que notre protocole de précipitation optimisé épuisera 99,8% de ce SDS, tout en récupérant le protéome quantitativement. Le laboratoire Doucette a démontré que l’inclusion de sel permet de récupérer un échantillon de protéome de manière complète, avec un biais minimal en faveur d’une récupération plus rapide des espèces de poids moléculaire élevé, et sans biais statistiquement significatif basé sur l’hydrophobicité ou la charge [2,3]. Les études subséquentes du groupe ont montré qu’une augmentation de 97 % de l’acétone et l’inclusion de sulfate de zinc garantissent une récupération de >90 % des espèces de faible poids moléculaire jusqu’à 2 kDa et une récupération quasi quantitative pour les peptides de 1 kDa [4].

En facilitant une extraction assistée par SDS, il ne devrait pas y avoir de biais vers la récupération de la fraction plus hydrophile du protéome, et avec des protocoles de précipitation robustes qui récupèrent les protéines de tous les poids moléculaires jusqu’à 1 kDa, un workflow basé sur ProTrap XG assure une récupération complète de l’échantillon de protéome. Grâce à la récupération quantitative, nous optimisons la précision de la quantification de l’efficacité de la détection, même pour les protéines les moins abondantes (qui sont parfois les plus importantes). En outre, la récupération quantitative permet de réduire la limite de détection et de quantification, ce qui, dans le cas des biomarqueurs par exemple, peut permettre une détection plus précoce des maladies.

[1] Echan, Lynn A, Tang, Hsin-Yao, Ali-Khan, Nadeem, Lee, KiBeom, and Speicher, David W. « Depletion of Multiple High-abundance Proteins Improves Protein Profiling Capacities of Human Serum and Plasma. » Proteomics (Weinheim) 5.13 (2005): 3292-303.
[2] Crowell, Andrew M.J, Wall, Mark J, and Doucette, Alan A. « Maximizing Recovery of Water-soluble Proteins through Acetone Precipitation. » Analytica Chimica Acta 796 (2013): 48-54.
[3] Nickerson, Jessica L, and Doucette, Alan A. « Rapid and Quantitative Protein Precipitation for Proteome Analysis by Mass Spectrometry. » Journal of Proteome Research 19.5 (2020): 2035-042.
[4] Baghalabadi, Venus, and Doucette, Alan A. « Mass Spectrometry Profiling of Low Molecular Weight Proteins and Peptides Isolated by Acetone Precipitation. » Analytica Chimica Acta 1138 (2020): 38-48.