Préparation Top Down des échantillons avec le ProTrap

Téléchargez le protocole de préparation des échantillons Top Down en version anglaise (PDF)

Le protocole suggéré ci-dessous a été optimisé en utilisant des concentrations maximales et minimales de protéines de 0,5 mg/mL et 0,01 mg/mL respectivement et est fourni pour démontrer les utilisations potentielles du ProTrap XG.

Notre équipe travaille avec les clients pour optimiser les protocoles en fonction de votre workflow, de votre type d’échantillon et de vos objectifs de recherche. Prenez contact avec nous à l’adresse sales@allumiqs.com pour en savoir plus sur la manière dont nous pouvons vous aider.

NOTES DE PRÉPARATION
Le ProTrap XG est optimisé pour traiter 50 µg de protéines.
Pour une précipitation reproductible et maximale des protéines, la teneur maximale en SDS de votre échantillon pendant la précipitation doit être de 1 %. Si votre tampon d’extraction ou de lyse contient plus de 1% de SDS, diluez-le avec un tampon contenant une force ionique maximale de 300 mM.
Les vitesses d’essorage sont basées sur une microcentrifugeuse standard de paillasse avec un rotor de 24 x 1,5/2,0 ml.
Les temps indiqués le sont à titre indicatif.
S’il reste plus de quelques microlitres de liquide dans la cartouche de filtration après un essorage, replacez-la dans la centrifugeuse et recommencez la centrifugation, ou envisagez d’augmenter la vitesse d’essorage. Une vitesse de 3000 ×g (6000 rpm) est recommandée pour les centrifugations suivantes et le ProTrap XG a été testé jusqu’à 9000 ×g (10 000 rpm).

MATÉRIEL REQUIS
Tous les produits chimiques et réactifs doivent être de qualité ACS/HPLC ou supérieure.
Acétone
NaCl 5 M dans l’eau
80% Acide Formique Acid dans l’eau (refroidit à –20°C)
Eau réfrigérée

PROTOCOLE DE PRÉPARATION D’ÉCHANTILLONS TOP-DOWN

Pour une précipitation reproductible et maximale des protéines, la teneur maximale en SDS de votre échantillon pendant la précipitation doit être de 1 %. Si votre tampon d’extraction ou de lyse contient plus de 1% de SDS, diluez-le avec un tampon contenant une force ionique maximale de 300 mM. Pour une expérience optimale, votre échantillon doit contenir au moins 50 mM de NaCl. Si vous devez ajouter du NaCl, utilisez une solution de NaCl 5 M.

Ne laissez pas la membrane de la cartouche de filtration sécher entre les étapes.
Visser un bouchon à la base de la cartouche de filtration.
Transférer 100 µl de l’échantillon de protéine dilué sur la cartouche de filtration bouchée.
Ajouter 400 µl d’acétone à température ambiante.
Boucher la cartouche de filtration et la secouer doucement, en l’inclinant à 45° maximum, pour mélanger les solvants.
Insérer la cartouche de filtration dans le tube de microcentrifugation et laisser la protéine s’agréger complètement pendant 30 minutes à température ambiante.
Avec le bouchon en place, centrifuger à 2500 ×g (5000 rpm) ×2 minutes.
Retirer la cartouche de filtration du tube de microcentrifugation, l’inverser et dévisser le bouchon.
Remettre la cartouche de filtration bouchée dans le tube de microcentrifugation et centrifuger à 500 ×g (2000 rpm) ×3 minutes. Jeter le solvant de l’écoulement. S’il reste du solvant dans la cartouche de filtration, centrifuger à nouveau l’unité pendant 2 à 5 minutes à 3 000 ×g (6 000 tr/min).
Laver le culot protéique avec 400 µl d’acétone. Centrifuger immédiatement à 500 ×g (2000 rpm) ×2 minutes. Jeter le solvant de lavage.
Replacez le bouchon Refroidir le culot dans la cartouche de filtration pendant 10 minutes à -20°C.
Ajouter 50 µl d’acide formique froid (-20°C) à 80 % dans de l’eau. Boucher la cartouche de filtration, la placer au congélateur pendant 10 minutes, puis la soumettre à une sonication pendant 1 minute.
Ajouter 450 µl d’eau réfrigérée ; boucher et mélanger le solvant au vortex.
Les protéines intactes peuvent être récupérées directement dans un tube de microcentrifugation propre, en centrifugeant à 350 ×g (2000 rpm) ×5 minutes.

Si un nettoyage supplémentaire des protéines est souhaité, les protéines résolubilisées peuvent également être soumises à une SPE en utilisant la cartouche SPE OPTIONNELLE fournie et le protocole de nettoyage des protéines/ peptides SPE.

Téléchargez le protocole de préparation des échantillons Top Down en version anglaise (PDF)